Un sistema 3D para modelar el desarrollo del páncreas humano y su atlas de transcriptoma unicelular de referencia identifican las vías de señalización necesarias para la expansión del progenitor

Resumen

La organogénesis humana permanece relativamente inexplorada por razones éticas y prácticas. Aquí, informamos el establecimiento de un atlas de transcriptoma unicelular del páncreas fetal humano entre 7 y 10 semanas posteriores a la concepción de desarrollo. Para interrogar las interacciones célula-célula, describimos InterCom, un R-Package que desarrollamos para identificar pares receptor-ligando y sus efectos posteriores. Además, informamos sobre el establecimiento de un sistema de cultivo de páncreas humano a partir de tejido fetal o células madre pluripotentes humanas, lo que permite el mantenimiento a largo plazo de los progenitores del páncreas en un medio mínimo definido en tres dimensiones. La evaluación comparativa de las células producidas en 2 dimensiones y las expandidas en 3 dimensiones al tejido fetal identifica que los progenitores expandidos en 3 dimensiones están transcripcionalmente más cerca del páncreas fetal.

Introducción

Los progenitores pancreáticos humanos aparecen por primera vez en el límite entre el intestino anterior y el intestino medio alrededor de los 30 días posteriores a la concepción (dpc), marcado por el factor de transcripción clave pancreático y factor de homeobox duodenal 1 (PDX1). Estas células son muy proliferativas y, por analogía con el páncreas de ratón, se supone que son multipotentes y, por tanto, pueden dar lugar a todos los tipos de células dentro del páncreas adulto. Entre ellos, las células acinares y ductales son responsables de la producción y secreción de enzimas digestivas y constituyen la mayor parte del páncreas adulto. Los islotes de Langerhans constituyen del 1 al 2% del órgano y abarcan múltiples tipos de células, incluidas las células β, que son cruciales para mantener la homeostasis de la glucosa. Se ha descrito que múltiples mutaciones causan defectos del desarrollo que resultan en disfunción pancreática, como diabetes neonatal y displasia quística.¹ . Algunos estudios también sugieren que la diabetes tipo 2 tiene un origen o predisposición en el desarrollo, aunque aparece más tarde en la vida^2 , 3 . A pesar de la disponibilidad limitada de muestras de páncreas fetal humano, los estudios histológicos revelaron que los principales hitos en el desarrollo del páncreas humano son similares a los observados en el ratón⁴ , al tiempo que apuntan a diferencias importantes, como un inicio tardío de la diferenciación endocrina, la aparición de células β primero en contraste con las células α en roedores⁵ , y una morfología de islote diferente⁶ . Más recientemente, se han generado importantes datos transcriptómicos, que van desde la secuenciación masiva del ARN del brote pancreático antes de la especificación del progenitor^7 ,8 a la secuenciación de poblaciones seleccionadas durante semanas de desarrollo^9 , 10 . Los datos transcriptómicos unicelulares están disponibles en ratones, en una etapa de desarrollo posterior en humanos¹¹ y en adultos^{12 , 13 , 14} .

La recapitulación del desarrollo del páncreas in vitro también ha sido de gran interés, siendo el principal incentivo el potencial de usar células β para terapias de reemplazo para tratar la diabetes. Se desarrollaron varios protocolos para diferenciar las células β de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Estos sistemas in vitro son útiles para complementar estudios descriptivos sobre páncreas fetal humano aislado. Además, los organoides pancreáticos o esferas derivadas de células hPSC son otra herramienta para estudiar el desarrollo del páncreas humano, pero hasta ahora no se han comparado directamente con el páncreas fetal humano ^{20 , 21 , 22 , 23} .

Aquí presentamos un conjunto de datos de transcriptoma unicelular que abarca el desarrollo fetal de 7 a 10 semanas después de la concepción (wpc), que usamos como punto de referencia para un nuevo sistema de cultivo de progenitores pancreáticos. Si bien la mayoría de los métodos de diferenciación del páncreas derivados de células madre embrionarias humanas (hESC) se han centrado en la producción de células β para la terapia de la diabetes, nuestro objetivo era atrapar a los progenitores in vitro en un estado lo más cercano posible a in vivo, en lugar de forzar su diferenciación en proporciones y tiempos no fisiológicos. Este sistema permite la autoorganización y la expansión a largo plazo de los progenitores pancreáticos. Debido a la robustez lograda con este método, lo desarrollamos para realizar un cribado de moléculas pequeñas e identificar los requisitos mínimos necesarios para la autorrenovación de los progenitores pancreáticos humanos in vitro.

Resultados

Un atlas de transcriptoma unicelular del páncreas fetal

Hemos informado anteriormente sobre el perfil transcripcional de poblaciones a granel clasificadas aisladas del páncreas fetal humano, que incluía progenitores, progenitores endocrinos y células endocrinas [ ^9] . También hemos estudiado su perfil de expresión unicelular (EP) mediante qPCR ²⁴ unicelulares . Aquí utilizamos MARS-seq ²⁵ para perfilar transcripcionalmente 1465 células entre 7 y 9 + 6 wpc (Fig. 1a-c ). Pudimos mapear las principales poblaciones de células en función de su EP. Identificamos una población prominente de células mesenquimales marcadas por una amplia expresión de VIM , DCN y múltiples colágenos. La otra población principal estaba compuesta por progenitores con amplia expresión de PDX1 ,SOX9 y KRT19 . También identificamos una pequeña población (1,8%) de células endocrinas, marcada por la expresión de CHGA, ISL1 e INS . De acuerdo con informes anteriores sobre la aparición retardada de células α en humanos, no se detectó GCG en esta población ^26 , 27 . Tipos de células no pancreáticas, tales como neuronas ( GAP43 , PRPH ) y las células rojas de la sangre ( ALAS2 , HBG1 ) también estaban presentes (Fig. 1d). Entre la población de progenitores pancreáticos, se encontraron tres EP separados. El primer tipo de célula y más abundante correspondía a una población similar a los progenitores de tronco de ratón ^28 , 29 con mayor expresión de SOX9 , HNF1B, HES1 y NKX6-1 (Fig. 1e , Fig. 1 complementaria ). Curiosamente, también se encontró que SPP1 , un marcador ductal conocido en el páncreas humano adulto ³⁰ , estaba aumentado en esta población. El segundo grupo tenía un EP muy similar a los progenitores del tronco, pero además tenía niveles aumentados de CDK1 y PCNA, entre otros marcadores que sugerían células en proliferación activa (Fig. 1d) . ). Por último, encontramos células donde CPA1 , RBPJL y CEL estaban altamente expresados (Fig. 1f ), lo que sugiere una población similar a los progenitores de punta de ratón ³¹ . Algunas células dentro de la población progenitora tip también expresaron PRSS1 , lo que indica que pueden ser células acinares tempranas. También encontramos que CTRB2 es muy específico para esta población. Se proporciona una lista que contiene muchos marcadores adicionales para cada población en los Datos suplementarios 1 , y varios marcadores conocidos se mapean en el UMAP en la Fig. 1c suplementaria .

Figura 1 — **Fig. 1: Un atlas de transcriptoma unicelular del páncreas fetal.**

Para evaluar si había diferencias entre los EP de ratón y humanos, comparamos nuestro conjunto de datos con un conjunto de datos previamente informado que contiene todos los tipos de células pancreáticas en una etapa comparable de desarrollo ³² . Esta comparación reveló poblaciones similares en los conjuntos de datos de ratones y humanos (Fig. 1a complementaria ). Para cada población se establecieron los 50 genes más variables entre diferentes poblaciones humanas, lo que permitió discriminar a cada uno de ellos. Luego exploramos si su expresión sería similar en el ratón (Fig. 1g ). Si bien se encontró que la mayoría de los genes marcan una proporción similar de células y tienen una abundancia comparable por célula, observamos algunas diferencias. En particular, SOX9 , KRT8 y SUCLG1se expresaron en más células y en niveles más altos en ratón, mientras que se observó lo contrario para RBPJ, EGR1 y TM4SF1 en los progenitores del tronco (Fig. 1g ). En los progenitores tip, RBPJL , TM4SF1 y 4 , GATM , EGR1 , FGFR4 y FOS se expresaron en más células y en un nivel más alto en humanos. Además, aunque CPA1 se enriqueció en ratón, CPA2 se enriqueció en humano (Fig. 1g). Con respecto a las células endocrinas humanas, las células que capturamos tenían una firma con similitudes tanto con los progenitores endocrinos de ratón como con las células endocrinas (Fig. 1g ). Se obtuvieron resultados cualitativamente similares al incluir un conjunto de datos de ratón adicional de Bastidas-Ponce et al. ³³ .

Además de revelar la expresión de genes individuales en estas poblaciones, investigamos los eventos funcionales de comunicación célula-célula entre los diferentes tipos de células. Para ello, desarrollamos InterCom, un modelo computacional mecanicista que integra eventos de unión extracelular con cascadas de señalización intracelular y regulación transcripcional. Al emplear una colección de interacciones ligando-receptor seleccionadas manualmente, InterCom asigna una puntuación a cada interacción que considera la expresión promedio de ambas moléculas y evalúa su importancia. Múltiples interacciones entre la matriz y las integrinas, así como otros receptores de la matriz, como DDR1 ^34, exhibieron las puntuaciones de fuerza más altas (Datos suplementarios 2para una lista global). Además, identificamos interacciones a través de la vía TGFβ que involucra a BMP7 en el epitelio y BMPR2 en el mesénquima / epitelio, como se observó previamente en ratones ^35 , 36 , así como el par TGFB2 / TGFBR1 dentro del epitelio (Fig. 1h , Datos suplementarios 2 ). . Al igual que en los ratones, la vía del FGF pareció señalar con ambos ligandos y los cuatro receptores en el epitelio y el mesénquima. Una diferencia notable fue que mientras FGF10 y 7 son los ligandos informaron en ratones, FGF2 y 9 fueron los más abundantes en humanos en estas etapas (Fig. 1h , complementario Fig. 1b, Datos suplementarios 2 ). También se sabe que la vía EGF opera durante el desarrollo del páncreas del ratón, y también se detectó en nuestro análisis. EGFR estaba presente en el epitelio fetal humano, pero los ligandos EFGR que detectamos en humanos, a saber, TGFA , EFEMP1 / FBLN3 ³⁷ , y otro posible ligando SPINK1 ³⁸ , eran diferentes de los reportados previamente en el ratón ³⁹ (Fig. 1h , Fig. Complementaria. 1b , datos suplementarios 2 ). Además, encontramos que PDGFA se produjo en el epitelio y su receptor PDGFRAse detectó en el mesénquima (Fig. 1h , Fig. suplementaria 1b , Datos suplementarios 2 ). También se predijo que las vías de guía de axones, incluidas SLIT2-ROBO1, que se han investigado recientemente en el páncreas ^{40 , 41 , 42 , 43 de} ratón, y SEMA3C-NRP2, que no lo ha hecho, enviarían señales al mesénquima (Fig. 1h ). En comparación, las herramientas de última generación para el análisis de la comunicación entre células no fueron capaces de recapitular estas interacciones (Nota complementaria 1, Datos complementarios 3). Sin embargo, complementan las interacciones de Intercom, que están restringidas por diseño a ligandos secretados, con interacciones basadas en el contacto célula-célula que implican, por ejemplo, la señalización Notch.

Un sistema de cultivo 3D a largo plazo de progenitores pancreáticos humanos

Para complementar estas observaciones estáticas, desarrollamos un sistema de cultivo para permitir el estudio del desarrollo del páncreas humano en tres dimensiones. Se han optimizado modelos in vitro de desarrollo del páncreas humano para la producción de células β con el fin de terapias de reemplazo celular para la diabetes. Aprovechamos estos protocolos para producir progenitores de páncreas en cultivos bidimensionales (2D), a partir de hESC o líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Dichos progenitores se volvieron a sembrar en condiciones tridimensionales (3D) en Matrigel, con un medio de cultivo que contenía FGF2, B27 e inhibidor de ROCK (Y-27632), basado en un medio de cultivo que diseñamos previamente para el cultivo 3D de ratón. progenitores del páncreas ⁴⁴ ( Fig.2a). Usamos dos protocolos de diferenciación publicados previamente que generaron de manera confiable altos porcentajes de células PDX1 + al final de la etapa de especificación del progenitor pancreático ^16 , 45 (Fig. 2b ). Se ha demostrado que los progenitores pancreáticos capturados de esta manera son susceptibles de expansión cuando se cultivan conjuntamente con una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón ⁴⁶ .

Figura 2 — **Fig. 2: Un sistema de cultivo mínimo que permite el cultivo a largo plazo de esferoides humanos que albergan progenitores pancreáticos.**

En nuestras condiciones de cultivo 3D, los progenitores pancreáticos derivados con cualquiera de los protocolos formaron esferas y esferoides (a partir de entonces, en general, PP-esferoides) que posteriormente podrían pasar cada 10 días (Fig. 2c ). Los marcadores progenitores pancreáticos SOX9 , HNF1B , HES1 y ONECUT1 se expresaron de manera estable, mientras que se observó un aumento modesto de los marcadores progenitores PDX1 y FOXA2 , así como del marcador progenitor / ductal KRT19 , particularmente en PP-esferoides pasados más de diez veces. También observamos un aumento constante de GP2 , un marcador de superficie expresado en progenitores multipotentes humanos ¹⁰(Figura 2d ). El marcador progenitor endocrino y del tronco NKX6-1 se expresó de forma baja e incluso indetectable en 6 de las 20 muestras analizadas (Fig. 2a complementaria ). Mientras que PDX1, SOX9 y CDH1 se expresaron homogéneamente, NKX6-1 fue heterogéneo (Fig. 2e, f ). Morfológicamente, detectamos ambas esferas con células organizadas alrededor de una gran luz central y esferoides con pequeñas luces que formaron redes parcialmente conectadas a lo largo del tiempo ( Fig.2e). Encontramos que el método de cultivo de expansión presentado es robusto en múltiples líneas de hESC (HuES4, H1 y H9) e iPSC (SBAD3.1 y SBAD3.4). Además, lo encontramos adecuado para el cultivo primario de células disociadas del páncreas fetal humano (esferas fetales). Pudimos expandir las esferas fetales durante al menos tres pases y observamos que las células no endodermos (p. Ej., Mesenquimatosas) se agotaban progresivamente (Fig. 2d complementaria ), mientras que se conservaba la expresión del marcador progenitor (Fig. 2b, c ). Aquí, como en los objetos derivados de hESC, observamos tanto esferas con una luz grande (Fig. 2d complementaria , pasaje 1) como esferoides con una red de luz delgada (Fig. 2c complementaria ).

Evaluación comparativa de células in vitro con el páncreas fetal humano

Para evaluar la similitud de las células expandidas en cultivo con las células endógenas, comparamos el modelo secuenciando 2063 células PP-esferoides y comparándolas con el conjunto de datos del páncreas fetal mencionado anteriormente. Además, para evaluar el efecto del cultivo en 3D, incluimos 662 progenitores de páncreas producidos en 2D a partir de hESC / iPSC. También incluimos 662 células de las esferas fetales, para probar el efecto del medio de expansión directamente sobre las células fetales. Para restringir la comparación a los tipos de células pancreáticas, excluimos las células pancreáticas no epiteliales antes de continuar con el análisis (Fig. 3a , b). Esto incluyó la mesenquimal, neural, y las células rojas de la sangre a partir de los páncreas fetal (Fig. 1), así como una pequeña proporción de mesénquima que surge de las esferas fetales (Fig. 2d complementaria ). La reducción de la dimensionalidad resultó en cuatro grupos principales. Dos grupos tenían un EP similar al progenitor ( SOX9 , PDX1 ), uno parecía ser ductal ( CFTR , BICC1 ) y el último era un grupo de células que expresaban marcadores endocrinos ( CHGA , NEUROD1, INS, GHRL ) (fig. 3c– e ). Sorprendentemente, encontramos que las muestras de páncreas fetal humano y los progenitores 2D segregados en diferentes grupos (Fig. 3b). Las células 2D cayeron principalmente dentro de los grupos de células «progenitores 1» y ductales, mientras que las células del páncreas fetal humano se limitaron al grupo de «progenitores 2» (Fig. 3c ). La excepción fue el pequeño grupo endocrino, que contenía células de todas las muestras (Fig. 3b , c). En particular, tanto los PP-esferoides expandidos en 3D como las esferas fetales se distribuyeron en los cuatro grupos, lo que indica que al menos parte de las células progenitoras que las componen tenían un EP que se parecía más a los progenitores del páncreas fetal. Marcadores hepáticos tempranos ( AFP , FABP1 , APOL1 y 2, etc.) así como los marcadores progenitores del páncreas GP2 , SPP1 y ONECUT2se enriquecieron en el grupo ‘progenitores 1’ que contiene las células del cultivo 2D (Fig. 3c-f , Fig. 3a complementaria ). DLK1 , NKX6 -1, MNX1 y los genes de respuesta temprana ( FOS , JUN , EGR1 ) aumentaron en el grupo ‘progenitores 2’, enriquecido en células recién disociadas del páncreas fetal (fig. 3c-f ).

figura 3 — **Fig. 3: Evaluación comparativa de células in vitro con páncreas fetal humano.**

Una comparación directa de células cultivadas en 3D y en 2D, excluyendo todas las demás poblaciones, dio más poder para discriminar diferencias y mostró que las células en 2D tenían marcadores hepáticos enriquecidos ( TTR , AFP , APOE ), mientras que las células en 3D expresaban más GP2 , AGR2 , ANXA4 y SPP1 (Fig. Complementaria 3c ). En particular, los marcadores de hígado encuentran en 2D progenitores se expresaron en células que también expresan marcadores pancreáticos, y los niveles de expresión eran altos en todas las células y más alto que en cualquier otra condición, incluso en vivo (complementario Fig. 3a). Otra diferencia notable entre 2D y 3D fue el mayor porcentaje de células en G2 / M en condiciones 3D (3% en 2D frente al 15% en 3D), según se estima en base a la expresión de genes anotados en el ciclo celular ⁴⁷ . Es probable que esto sea sintomático de inhibición por contacto en 2D. También observamos que mientras que las células producidas usando diferentes protocolos distribuidos de manera similar en el UMAP global, la diferenciación espontánea temprana en la ruta endocrina se observó solo en Rezania et al. ¹⁶ (Fig. Complementaria 3g ), probablemente como resultado de la inhibición de BMP ^18 , 48 . Los PE de los progenitores que surgen de Ameri et al. ⁴⁵ o Rezania et al. ^dieciséislos protocolos fueron en general muy similares. Sin embargo, se identificaron algunas diferencias al comparar solo las dos poblaciones en 2D, siendo la más notable una mayor expresión de ID1 e IGFBP7 en células diferenciadas con Ameri et al. ⁴⁵ , y mayor expresión de los marcadores hepáticos FGB y APOC3 en células diferenciadas con Rezania et al. ¹⁶ (Fig. 3f complementaria ), posiblemente debido a la menor expresión de PDX1, que reprime los genes del hígado ⁴⁹ . Los PP-esferoides resultantes producidos a partir de los dos protocolos convergieron en un EP similar (Fig. Suplementaria 3d). En pasajes tempranos, se observó la presencia de marcadores hepáticos coexpresados con marcadores pancreáticos en PP-esferoides, aunque menor que en cultivo 2D. Esto sugiere la presencia de células inmaduras dotadas de la potencia para formar múltiples órganos (Fig. Complementaria 3c, d ). Sin embargo, con el tiempo, estas células evolucionaron a un destino pancreático más estricto como se ve por la pérdida de AFP , APOE y APOA1 (Fig. 3c complementaria ).

Al comparar las células fetales in vitro e in vivo, observamos que un subconjunto de los progenitores divergieron in vitro, adquiriendo una firma ductal más madura ( CFTR , SPP1 , SOX9 ^alta ) o una firma progenitora ( PDX1 , SOX9 ^baja ) (Fig. Complementaria. 3a, h ). La última población, de manera similar a los PP-esferoides, también tenía mayores GP2 y AGR2 . La inmunocitoquímica sugirió además heterogeneidad basada en la expresión de CFTR en pequeñas esferas huecas con bajos niveles de PDX1 y MUC1 en esferas huecas con altos niveles de PDX1 y en esferoides, que recubren redes complejas de lumen estrecho (Fig. 3b complementaria). ).

Tasas de proliferación fisiológicamente relevantes de PP-esferoides

Una de las características auténticas de los progenitores es la capacidad de proliferar. Determinamos que en nuestro sistema de cultivo, los progenitores podían pasar al menos 20 veces, incluidos los ciclos de congelación-descongelación, mientras proliferaban de manera estable (Fig. 4a ). Después de alrededor de 20 pases, las muestras se almacenaron, sin indicación de que no se podrían mantener en cultivo indefinidamente. Durante cada pase, después de 10 días en cultivo, los PP-esferoides produjeron una expansión de 15 veces en promedio, lo que representa aproximadamente un tiempo de duplicación celular de 65 h (Fig. 4b ). Esto es comparable a los informes previos de la proliferación de progenitores pancreáticos in vitro ⁴⁶ , aunque probablemente subestima las tasas de proliferación, ya que no explica la muerte celular tras la nueva placa.

Figura 4 — **Fig. 4: Las condiciones utilizadas para mantener PP-esferoides conducen a tasas de proliferación fisiológicamente relevantes.**

Comparamos los niveles de MKI67 en PP-esferoides, esferas fetales y páncreas fetal para evaluar la relevancia de la proliferación in vitro en comparación con in vivo y encontramos un aumento del doble en PP-esferoides en comparación con las otras dos muestras (Fig. 4c , D). En las esferas fetales, sin embargo, los niveles de MKI67 fueron muy similares a los encontrados in vivo, lo que indica que las condiciones de cultivo están recapitulando apropiadamente los niveles de proliferación fisiológica en los progenitores pancreáticos. El aumento observado en PP-esferoides podría ser simplemente el resultado de una anomalía genómica que da como resultado una hiperproliferación, que es común entre las líneas de hPSC ⁵⁰ . Sin embargo, el cariotipo de las líneas que inicialmente eran normales se mantuvo normal en P5 y P12 (Fig. 4e ).

La diferenciación endocrina se puede desencadenar en PP-esferoides expandidos

Otro sello distintivo de los progenitores del páncreas es su capacidad para diferenciarse. Los progenitores pancreáticos contenidos en PP-esferoides se diferenciaron espontáneamente en células endocrinas en el medio de expansión, con una baja eficiencia, como lo demuestra la presencia de un pequeño grupo endocrino (22 células, 1,1% de todas las PP-células esferoides) (Fig. Complementaria). . 3d, e ). Por pequeño que sea, este porcentaje no es diferente al que se encuentra en un páncreas humano adulto, con islotes que constituyen sólo el 1-2% de todo el órgano ⁵¹ . El porcentaje de células endocrinas observadas en el páncreas fetal secuenciadas (20 células, 1,8% de todas las células fetales excluyendo el mesénquima) también está de acuerdo con esto (Fig. 1c , d). Las células de los grupos endocrinos expresaron genes endocrinos típicos (NEUROD1 , INSULINA , CHRGA , NEUROG3 , GHRL , FEV , etc.) (Fig. 3d ).

Luego desafiamos a los progenitores pancreáticos expandidos para que se diferenciaran sometiendo PP-esferoides a las etapas 5 (3 días) y 6 (7 a 14 días) de Rezania et al. ¹⁶ protocolo (Fig. 5a ). A los 7 días del estadio 6, al día 10, observamos un aumento en la expresión de varios genes endocrinos ( NEUROG3 , INS , GCG , NKX6 -1, PAX4 , ARX , MAFA ) y mantenimiento de PDX1 , mientras que SOX9 estaba disminuido (Fig. . 5b). Cuantificamos el número de células C-PÉPTIDO + (un péptido escindido de PRO-INSULINA) y GLUCAGON + mediante citometría de flujo, que mostró porcentajes más altos de C-PÉPTIDO + sobre las células GLUCAGON +, y alrededor del 10% de las células hormonales eran bihormonales (Fig. 5C ). La diferenciación continuó progresando entre los días 10 y 17 en el medio de la etapa 6, alcanzando un promedio de 23% de células endocrinas (Fig. 5b , c). También confirmamos que el número de células PDX1 + permaneció cerca de lo que se observó en PP-esferoides en expansión (Fig. 5c ). Las inmunotinciones revelaron que, después del tratamiento, la mayoría de los esferoides de PP contenían una mezcla de células con alto contenido de INSULINA + / PDX1 y células PDX1 +. Los niveles de NKX6-1 también fueron marcadamente más altos que en el medio de expansión, aunque todavía heterogéneos (fig. 5d ). En resumen, podemos concluir que una porción significativa de las células dentro de los PP-esferoides se comportan como progenitores y tienen el potencial de progresar hacia un destino endocrino. Este fue el caso independientemente del protocolo utilizado para diferenciar los progenitores pancreáticos y entre líneas celulares (HuES4, H1, H9 y SBAD3.4). Los PP-esferoides de pasaje temprano (P3, P4, P5) y tardío (P12, P17) respondieron de manera similar y aumentaron la expresión de genes endocrinos (Fig. 4a complementaria ). A pesar de un desplazamiento consistente hacia el destino endocrino después del tratamiento, se observó variaciones significativas (Fig. 5b , c, complementario Fig. 4a). Estos se debieron principalmente a una baja capacidad de diferenciación cuando se pasaba solo una vez después de descongelar un lote, que se rescató en pasajes posteriores (compárese la Fig. 4a, by la Fig. 5c complementaria ). Entre las líneas celulares, H1 y H9 fueron las más potentes para diferenciar (Fig. 4a complementaria ).

Figura 5 — **Fig. 5: La diferenciación endocrina se puede desencadenar en PP-esferoides expandidos.**

Para evaluar más a fondo la potencia de nuestros progenitores expandidos, aplicamos un protocolo de diferenciación exocrina ⁵² a PP-esferoides. Observamos un aumento significativo en la expresión de PTF1A , un progenitor tip conocido y marcador acinar en el ratón ^31 , 53 , que también se ha informado como un marcador progenitor tip en humanos ¹¹ . CPA1 y AMY2A también aumentaron ligeramente, aunque no significativamente (Fig. 4c complementaria ). Sin embargo, el modesto aumento de estos genes hace que sea poco probable que las células se conviertan en células acinares auténticas.

El cribado revela el control de la proliferación de PP por las vías EGF y FGF

El sistema de cultivo 3D tiene la notable capacidad de mantener a los progenitores del páncreas en un estado proliferativo similar al fetal durante largos períodos de tiempo. Por tanto, podría ser una valiosa plataforma in vitro para investigar los mecanismos del desarrollo del páncreas humano mediante experimentos de interferencia. La capacidad de producir un gran número de progenitores a partir de PSC y la alta reproducibilidad del sistema de cultivo de expansión hacen posible el cribado a gran escala. Como prueba de concepto, seleccionamos varias vías que se sabe que tienen un papel destacado en el desarrollo del páncreas, ya sea en ratones o humanos, y probamos cómo su modulación afectaba la proliferación de esferoides PP. Cuando fue posible, aplicamos tanto activadores como inhibidores para una vía determinada. Dejamos que las células pasadas formaran PP-esferoides durante 48 h antes de comenzar los tratamientos. Luego fueron tratados durante 8 días, 6a ). Como primera lectura, medimos el nivel de ATP en cada pozo como proxy del número de células. El ensayo fue de alto rendimiento, con un excelente factor Z (Z ′ = 0,8) y una alta relación señal / fondo (s / b = 4,5). Una segunda lectura fue un ensayo de diferenciación endocrina basado en qPCR para la ejecución de CHGA en una placa paralela. El resultado más sorprendente fue la fuerte reducción en el número de células después del tratamiento con el inhibidor de EGFR Gefitinib y el inhibidor de FGFR1 / 2/3 Infigratinib (Fig. 6b). Sin embargo, la adición de EGF no dio como resultado un aumento del número de células. La eliminación de FGF2 del medio de cultivo basal tampoco afectó al número de células. Sin embargo, esto podría deberse a un efecto retardado debido a la presencia de FGF2 durante los primeros 2 días de cultivo. La inhibición de notch por DAPT también causó una reducción modesta en los progenitores del páncreas y mostró niveles más altos de CHGA y NEUROG3 , junto con el otro inhibidor de notch probado (GSiXX) (Fig. 6b , Fig. 5a complementaria). ). El efecto más pronunciado en el aumento del número de células fue causado por la activación de la vía WNT, tanto por el tratamiento con el inhibidor de GSK-3 CHIR99021 como por la suplementación con WNT3a y R-Spondin. También se observó un efecto modesto sobre el número de células tanto en la activación como en la inactivación de la vía de la AR, la inhibición de la vía de las BMP a través de LDN193189 o el tratamiento con PGE2.

figura 6 — **Fig. 6: Un sistema de modelo de desarrollo susceptible de cribado revela la importancia de las rutas de EGF y FGF en la proliferación de progenitores.**

La medición de los niveles de ATP como proxy del número de células (e implícitamente la proliferación) es adecuada para la detección, pero presenta muchos factores de confusión (por ejemplo, cambios metabólicos). Así, procedimos a validar las condiciones más prometedoras para cambios en la proliferación. El tiempo del ensayo fue idéntico al de la selección inicial con una excepción: debido al efecto drástico observado con el tratamiento con Infigratinib, restringimos el tratamiento con este compuesto a 24 h (el día 9 después de la reposición) (Fig. 6c ). Luego procedimos a medir los niveles de células EdU + en los días 5 (tratamiento de 3 días) y 10 (tratamiento de 8 días) (Fig. 6c ). Después de 3 días de tratamiento, la única condición que resultó en un mayor porcentaje de células EdU + por citometría de flujo fue el tratamiento con WNT3a y R-Spondin (Fig. 6d). Esto también se confirmó por el tamaño aumentado de los organoides observado por inmunocitoquímica en el día 10 (Fig. 6e ). Sin embargo, el día 10 ni el análisis de flujo de EdU ni la inmunotinción mostraron un aumento sostenido de la proliferación. También notamos que el tratamiento con WNT3a + R-Spondin disminuyó globalmente los niveles de PDX1 (Fig. 6e ). Complementariamente, verificamos que la inhibición de la vía WNT en condiciones basales con el inhibidor de puercoespín IWP-L6 no resultó en una disminución de la proliferación. Después de 8 días de tratamiento con Gefitinib o eliminación de FGF2, se observó una disminución del porcentaje de células EdU + (Fig. 6d ). El tratamiento con Infigratinib también resultó en una disminución drástica de las células en proliferación después de solo 24 h de tratamiento (Fig. 6d ).

Para probar aún más la relevancia de estos resultados, repetimos la misma validación del ensayo en esferas fetales (Fig. 5b complementaria ). Observamos resultados similares en general, con la excepción de que no se observó ningún aumento en la proliferación después del tratamiento con WNT3a + R-spondina (Fig. 5c complementaria ).

El efecto de la inhibición de la señalización de EGF (Fig. 6 ) nos hizo volver a visitar los datos de secuenciación de una sola célula para investigar la expresión de los componentes de la vía. Además de los ligandos de EGF TGFA , EFEMP1 y SPINK1 revelados in vivo por InterCom (Fig. 1h ), detectamos un cuarto posible ligando, AREG tanto en el páncreas fetal como en muestras in vitro (Fig. 7a ). A pesar de que estas células representaban una pequeña proporción (4%) de la población en general, que agrupan claramente en el conjunto de datos resultante de la fusión (Figs. 3 c, d y 7b). Las mismas células también formaron un grupo prominente dentro de los conjuntos de datos aislados de esferas fetales y esferoide PP, pero no en los progenitores 2D (Fig. Complementaria 3e, h ). En el mismo grupo, encontramos niveles más altos de CXCL8 y FGF19 , los cuales están involucrados en la cascada de señalización AREG ^54 , 55 (Fig. 7b, d ). SPINK1 también se enriqueció en los grupos que expresan CFTR , mientras que EFEMP1 y TGFA se distribuyeron de manera más homogénea (Fig. 7b ). Además, tanto EGFR como ERBB3se expresaron en las muestras 3D, así como ERBB2 y 4 en menor grado (Fig. 7a ). En general, había muy pocas células que expresaban ligandos de FGF a niveles detectables, pero notablemente los niveles de FGF2 fueron significativamente más bajos en las muestras 3D en comparación con el páncreas fetal humano, lo que sugiere que los progenitores pancreáticos responden al FGF2 presente en el medio regulando negativamente la expresión endógena (Fig. 7c ).

figura 7 — **Fig. 7: Expresión de los componentes de las vías de EGF y FGF.**

Discusión

En este estudio, desarrollamos un sistema para investigar el desarrollo temprano del páncreas fetal humano en tres dimensiones, enfocándonos en mantener a los progenitores del páncreas en cultivo, en un estado cercano a sus contrapartes in vivo. La solidez del sistema lo hace apropiado para el cribado de alto rendimiento con moléculas pequeñas, o en el futuro cribado CRISPR para investigar los mecanismos del desarrollo del páncreas humano, como el mantenimiento y la expansión de progenitores, la formación de redes ductales o la inducción endocrina. Además, permitiría probar el efecto de genes identificados por genetistas humanos que predisponen a la diabetes u otras afecciones pancreáticas sobre el desarrollo pancreático. Si bien la mayoría de los métodos de diferenciación del páncreas derivados de hESC se han centrado en la producción de células β para la terapia de la diabetes, nuestro sistema es diferente en sus objetivos, intentar atrapar a los progenitores in vitro en un estado lo más cercano posible al in vivo en lugar de forzar su diferenciación en proporciones y tiempos no fisiológicos. Como sistema para estudiar el desarrollo del páncreas humano, ponemos énfasis en comparar las células con las que también caracterizamos in vivo en un atlas de transcriptoma unicelular.

Atlas del desarrollo del páncreas humano

Aquí presentamos un conjunto de datos transcriptómicos a nivel de una sola célula del páncreas fetal humano en el primer trimestre (7-10 wpc). Este estudio amplía nuestro transcriptoma global anterior de poblaciones ordenadas ⁹ al proporcionar una resolución de una sola célula y distinguir diferentes poblaciones progenitoras. Corroboramos la expresión de SOX9 , PDX1 y KRT19 en los progenitores del páncreas hasta las 10 semanas ^{5 , 11 , 56 , 57} . Las poblaciones progenitoras de la punta y el tronco se han caracterizado bien en ratones ⁵⁸ y también se han sugerido en humanos, marcadas por la pérdida de GATA4 en las estructuras similares a conductos centrales del órgano ⁵⁷Además, caracterizamos las diferentes poblaciones de progenitores, comparando múltiples genes expresados diferencialmente entre punta / tronco en ratón y observamos el mismo comportamiento en el páncreas fetal humano. Identificamos una población de progenitores tip, con mayor expresión de GATA4, PTF1A, NR5A2 y CEL , entre otros, en comparación con los grupos de troncos (Fig. 1f ). Dentro de esta población, un pequeño número de células expresaron PRSS1 pero carecían de más marcadores de madurez. Esto está de acuerdo con otros informes donde el inicio de la especificación acinar fue visto por 7 wpc ^57 , 59. Además de los genes mencionados anteriormente, identificamos otros asociados con esta población progenitora de punta (Datos suplementarios 1 ). De manera similar, identificamos una población que recuerda a la población progenitora del tronco del ratón con niveles aumentados de SOX9 , HNF1B , NKX6-1 y HES1 (Fig. 1e ). Curiosamente, el marcador SPP1 también se incrementó en los progenitores del tronco, aunque más tarde se restringe al epitelio ductal en el páncreas adulto ³⁰ . Se ha demostrado que SPP1 se expresa en progenitores durante el desarrollo del ratón y, a la luz de nuestros datos, puede ocurrir lo mismo en humanos ⁶⁰. Nuestro conjunto de datos corrobora las observaciones anteriores sobre el momento del compromiso endocrino, con las primeras células comprometidas con el sistema endocrino que aparecen en la muestra de páncreas fetal de 7 + 3 wpc (~ 52 días) ^5 , 57 . Se necesitan más estudios para probar la función de mantenimiento del progenitor putativo de los genes identificados que se muestran en los datos suplementarios 1 . Varios genes cuyas mutaciones causan diabetes monogénica ( CEL y HNF1B ) ^{61 , 62 , 63} , predisponen a la diabetes tipo 2 (RBPJL ) ⁶⁴ , o causan displasia quística ( NPHP3 ) ⁶⁵ o insuficiencia exocrina (UBR1 ) ⁶⁶ se detectaron en nuestro conjunto de datos en estas primeras etapas de desarrollo. Si bien elegimos MARS-Seq como una técnica que permitiría la captura eficiente de las escasas muestras fetales y la recolección conveniente de muestras para una comparación óptima (sin efecto de lote), el número de células permaneció en miles, posiblemente impidiéndonos identificar células raras. poblaciones.

La comparación con conjuntos de datos unicelulares publicados en ratones ^32 , 33 identifica diferencias en la transcripción entre las dos especies, incluida la proporción de homólogos funcionales ( CPA1 / 2 ) y cambios importantes en el nivel de expresión génica ( SOX9 más alto en ratones, EGR1 en humanos).

Un análisis sistemático de la red de comunicación célula-célula entre todas las poblaciones de células reveló interacciones como PDGFA-PDGFRA del epitelio al mesénquima y otras esperadas de los estudios en ratones, principalmente a través de EGFR y FGFR. Entre ellos, combinando la comparación entre los EP de ratón y humanos, detectamos una conservación de los receptores pero muchas diferencias aparentes en los ligandos. Serían de interés más estudios sobre el papel de SEMA3C-NRP2, así como sobre SLIT2-ROBO1. La función de SLIT2 no se ha estudiado en el páncreas, pero un papel de ROBO1 / 2 en la promoción del mantenimiento del progenitor del páncreas ⁴¹ , clasificación de células endocrinas ⁴² y SLIT3 en la diferenciación endocrina ⁴¹sugieren múltiples actividades de esta familia en el desarrollo del páncreas. Nuestros datos sugieren actividades de señalización predominantes de SLIT3 mesenquimatoso a ROBO1 mesenquimatoso en el desarrollo humano. Como ROBO2 previene la activación del estroma en el ratón adulto ⁴³ , ROBO1 puede tener un papel similar en el desarrollo humano. Si bien la actividad de estas vías se sugiere computacionalmente, validamos funcionalmente las vías EGF y FGF, como se analiza más adelante.

Un sistema de cultivo 3D acerca a los progenitores pancreáticos a un estado similar al fetal

Con el fin de imitar el desarrollo de órganos, descubrimos que al cultivar progenitores pancreáticos derivados de hPSC en un nicho 3D con una suplementación mínima de citocinas, pudimos obtener progenitores que se parecían más a un EP fetal que sus contrapartes 2D. Aunque se ha informado del transcriptoma unicelular de poblaciones de células pancreáticas derivadas in vitro de las CEP ²² , la comparación con poblaciones in vivo es una evaluación importante de su similitud y es una fortaleza única de nuestro enfoque. Los progenitores dentro de nuestro sistema de cultivo 3D parecieron adquirir un destino pancreático más definido, disminuyendo la expresión de genes marcadores hepáticos que eran más prevalentes en condiciones 2D ( TTR , APOE , AFP , APOA1 ,APOA2 ). Este efecto fue incluso más pronunciado en pasajes posteriores, donde la expresión de APOA , APOE y AFP se redujo en comparación con pasajes tempranos (Fig. Complementaria 3a, c ). Esto sugiere que el cambio de un entorno 2D a uno 3D o la propagación durante largos períodos de tiempo es el principal impulso en la adquisición de un destino pancreático más estricto. Aunque la coexpresión de marcadores hepáticos y pancreáticos en células individuales no se ha informado previamente en progenitores pancreáticos producidos in vitro a partir de hPSC, los genes hepáticos descritos aquí también se detectan en conjuntos de datos disponibles públicamente que incluyen secuenciación masiva ⁶⁷ y secuenciación unicelular ⁶⁸utilizando diferentes protocolos de diferenciación. Varios también se detectan en el brote pancreático humano temprano a las 5 semanas, aunque más bajo que en el primordio del hígado ⁸ . Los marcadores hepáticos regulados negativamente en nuestro conjunto de datos también estaban abundantemente presentes antes de la expansión en Trott et al. ⁴⁶ y no fueron constantemente regulados a la baja en la expansión 2D (Datos suplementarios 4 ), argumentando que el efecto es exclusivo de nuestro medio de cultivo o de las condiciones 3D. Si bien la composición del medio de cultivo puede impulsar la expresión de varios genes, la comparación entre las esferas fetales y los esferoides de PP cultivados en el mismo medio solo se superpone parcialmente ( Fig.3b ), y varios genes se enriquecieron específicamente en cada una de estas dos poblaciones. (Fig. Complementaria. 3a ). En la práctica, es conveniente un sistema robusto y sencillo para la expansión de los progenitores del páncreas, ya que los experimentos con los progenitores del páncreas se pueden realizar rápidamente sin necesidad de una expansión y diferenciación prolongadas de hPSC. El sistema que desarrollamos permite el mantenimiento y estudio a largo plazo de los progenitores del páncreas, complementando un sistema de cultivo previo utilizando capas alimentadoras en 2D ⁴⁶. In addition, it enables the study of processes occurring in 3D, such as luminogenesis or cell delamination. The ability to differentiate into both α and β cells attests to the presence of progenitors at all stages, as well as the expression of NKX6-1, a gene that is normally lost in mature ducts. However, not all cells differentiate when subjected to differentiation protocols, which suggests that either feedback signals between cells limit differentiation (as known for the Notch pathway) or that PP-spheroids also contain more mature ductal cells that have lost the differentiation potential. Supporting this hypothesis, we show the presence of cells with ductal signatures and some heterogeneity in the expanded objects, both morphologically as well as by marker expression, a subset of objects exhibiting NKX6-1, MUC1, or CFTR (Fig. 2f , Fig. Complementaria 3b ). Aunque los progenitores del páncreas pudieron observarse en todas las etapas de cultivo según sus marcadores y su capacidad para diferenciarse, la diferenciación endocrina después de la expansión es menos eficiente que en los mejores métodos actuales de diferenciación pancreática de las hESC ^{15 , 16 , 18 , 19 , 69} , y es Actualmente no es el método de elección para la producción masiva de células endocrinas con fines terapéuticos. Aunque se indujo PTF1A después de aplicar un protocolo de diferenciación acinar, la eficacia limitada de este protocolo nos impide concluir si los progenitores que expandimos son multipotentes o bipotentes.

Dada su similitud con el páncreas fetal y su capacidad para expandirse y diferenciarse, creemos que este método de cultivo 3D será una herramienta útil para investigar procesos morfogenéticos a los que no se puede acceder de manera justa en 2D. La similitud en las tasas de proliferación entre las muestras de páncreas fetal humano y las esferas fetales indica que nuestro sistema de cultivo mantiene la capacidad de replicación innata de los progenitores, lo que lo convierte en un sistema excelente para diseccionar los mecanismos de autorrenovación de los progenitores pancreáticos.

La alta reproducibilidad muestra el potencial de un cribado de alto rendimiento

Tener la capacidad de generar una gran cantidad de progenitores pancreáticos abre la puerta a experimentos in vitro de alto rendimiento que podrían abordar preguntas oportunas sobre la biología pancreática humana. Como prueba de concepto, mostramos que el sistema de cultivo es susceptible de cribado. El cribado identificó la importancia de la señalización del receptor de EGFR y FGFR en la expansión del progenitor del páncreas, ampliando las observaciones previas en el ratón y en el ser humano ^70 , 71 . Con respecto a la vía de FGF, aunque se ha propuesto la señalización de FGF7 y FGF10 del mesénquima para expandir los progenitores del páncreas en ratones y humanos, mostramos que en las etapas que estudiamos, FGF7 y FGF10 se expresan en niveles mucho más bajos que FGF2 ,FGF9 y FGF13 cuyas actividades en el páncreas sería interesante de estudiar. Los receptores FGFR1 / 2/3/4 se expresaron todos ampliamente en células del epitelio y mesénquima (Fig. 7 ). Los niveles más altos de EGR1 , que es un objetivo de la vía FGF ⁷⁰ , así como otras vías, aumentan la posibilidad de una actividad más fuerte de la vía en humanos. En la pantalla que realizamos, no pudimos ver ningún requisito para la señalización de YAP en la expansión del progenitor del páncreas humano en contraste con informes anteriores sobre la proliferación de ratones y peces cebra ⁷. Esto puede deberse a un requerimiento menor en humanos o a la incapacidad de detectar algún efecto en las condiciones de cultivo que usamos, especialmente en presencia de mitógenos potentes como FGF2. El tratamiento con WNT3a + R-Spondin resultó en un aumento transitorio de la proliferación. WNT3a + R-Spondin se han utilizado previamente para expandir los progenitores del páncreas humano fetal in vitro, pero no son esenciales en nuestro sistema y, como inconveniente, observamos niveles reducidos de expresión de PDX1. Nosotros y otros hemos informado previamente que la señalización de WNT / β-catenina reprime PDX1 en el páncreas de ratón ^72 , 73 , y un mecanismo similar podría estar en juego aquí.

El experimento de detección también ofreció información sobre el sistema de cultivo 3D particular desarrollado aquí. A diferencia de los protocolos de cultivo de esferas y organoides pancreáticos publicados anteriormente, este método no se basa en la suplementación con EGF. Confirmamos que la adición de EGF no da como resultado una mayor proliferación, a pesar de que se requiere actividad de EGFR. Según la abundancia de ligandos in vivo e in vitro, TGFA , EFEMP1 , SPINK1 y AREG son los ligandos más probables en el desarrollo del páncreas humano en esta etapa. Curiosamente, se ha demostrado que AGR2 , que está altamente regulado al alza en 3D en comparación con las muestras 2D y fetales, estimula la AREGexpresión que conduce a la proliferación en el contexto de la regeneración del páncreas durante la pancreatitis ⁷⁴ . En ratón, BTC y EGF son los dos ligandos que se demostró que activan la vía de EGF ⁷⁵ , pero no se detectaron en nuestra secuenciación unicelular, lo que sugiere que sus niveles de expresión son muy bajos. Esto puede reflejar una diferencia de especie o una diferencia de etapa.

En general, el sistema que caracterizamos con gran detalle debería permitir más estudios de los progenitores pancreáticos en un entorno 3D. Conceptualmente, muestra que los progenitores pancreáticos se pueden capturar y mantener in vitro, de manera similar a lo que se logró hace muchos años cuando se estabilizaron las CEP in vitro de ratón y humano en un estado que normalmente es transitorio en el cuerpo. Desde entonces, muchos estudios han demostrado cómo diferentes medios hacen que las hPSC sean más o menos homogéneas y cómo se desvían de su estado atractor. Con el mismo espíritu, el sistema debería poder estudiar cómo las redes transcripcionales mantienen a los progenitores del páncreas en una cuenca atractora.

Métodos

Líneas de células madre pluripotentes humanas y condiciones de cultivo

Las líneas de hESC H9 y H1 se obtuvieron de WiCell. Las líneas SBAD3.1 y SBAD3.4 iPSC se obtuvieron del consorcio stemBANCC. La línea de hESC informadora HuES4 PDX1-GFP se informó anteriormente [ ^19] . Todas las líneas celulares fueron aprobadas para su uso en este proyecto por De Videnskabsetiske Komiteer, Region Hovedstaden con el número H-4-2013-057. Las líneas de hPSC se mantuvieron en diferentes condiciones dependiendo del protocolo de diferenciación a realizar. En el caso del protocolo basado en Ameri et al. ⁴⁵ , las células se mantuvieron en el DEF-CS 500 (Takara). En el caso del protocolo basado en Rezania et al. ^dieciséislas células se mantuvieron en medio mTeSR1 (Stem Cell Technologies) en Matrigel libre de LDEV calificado para hESC (Corning). Se realizaron cambios diarios medianas, y se cultivaron todas las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ . Las células se analizaron con regularidad para determinar el estado libre de micoplasmas. Cuando alcanzaron una confluencia de ~ 80%, las células se disociaron con TrypLE (Thermo Fisher), se contaron con el contador de células automatizado NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec), se lavaron en medio de cultivo y se volvieron a sembrar a una densidad de 40.000 células / cm ² . Para los pases, el medio mTeSR1 se complementó con inhibidor de ROCK 10 µM Y-27632 (Sigma) durante las primeras 24 h.

Muestras humanas

El tejido del páncreas fetal humano se obtuvo a partir del material disponible tras la interrupción electiva del embarazo durante el primer trimestre en los Departamentos de Ginecología del Hospital Universitario de Copenhague (Rigshospitalet) y el Hospital Hvidovre, Dinamarca. El comité de ética regional “De Videnskabsetiske Komiteer Region Hovedstaden” aprobó este estudio (número de permiso H-1-2012-007) y las mujeres dieron su consentimiento informado por escrito y oralmente. Ninguna de las interrupciones se debió a patología del embarazo o anomalía fetal. La edad fetal se determinó escaneando la longitud de la coronilla y la rabadilla y mediante la evaluación de la longitud del pie y se indica como semanas estimadas + días después de la concepción ⁷⁶ . Se aisló el páncreas y la mayor parte del mesénquima se eliminó manualmente.

Generación in vitro de progenitores pancreáticos a partir de células madre pluripotentes humanas

Generamos progenitores pancreáticos con dos protocolos distintos. Se cultivaron PSC humanas durante al menos tres pases antes de comenzar el procedimiento de diferenciación.

Protocolo adaptado de Ameri et al. ⁴⁵: Se hicieron pases de hPSCs (HuES4) como de costumbre y se dejó que alcanzaran la confluencia. El medio se cambió a diario y se realizaron lavados 1 × PBS (Thermo Fisher) al cambiar el medio entre etapas. Las células se cultivaron en 2D a lo largo de todas las etapas de los protocolos. Etapa 1 (1 día): las células se expusieron a medio RPMI GlutaMAX (Thermo Fisher) suplementado con 100 ng / ml de Activina A (Peprotech), CHIR 99021 3 µM (Axon) y suplemento B-27 sin insulina (Thermo Fisher). Etapa 2 (4 días): las células se expusieron a medio RPMI GlutaMAX suplementado con 100 ng / ml de Activina A y suplemento B-27 sin insulina. Etapa 3 (3 días): las células se expusieron a medio DMEM / F12 GlutaMAX (Thermo Fisher) suplementado con ácido retinoico 2 µM (RA; Sigma) y suplemento B-27 (Thermo Fisher). Etapa 4 (8 días):

Protocolo modificado de Rezania et al. ¹⁶ : Las hPSC (H9, H1, SBAD3.1 y SBAD3.4) se pasaron a placas recubiertas con Matrigel reducido con factor de crecimiento (GFR-Matrigel; Corning) diluido 1/30 en DMEM / F12 GlutaMAX. Las células se sembraron a 200.000-350.000 células / cm ²en mTeSR1 con inhibidor de ROCK 10 µM Y-27632 y se incubó hasta confluencia (24-48 h dependiendo de la línea celular específica). El medio se cambió a diario y se realizaron lavados 1 × PBS al cambiar de medio con diferente suplementación. Las células se cultivaron en 2D a lo largo de todas las etapas del protocolo. Etapa 1 (3 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 suplementado con 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax (Thermo Fisher), glucosa 10 mM (Fisher Scientific) y albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos al 0,5% ( BSA; Proliant). El medio se suplementó adicionalmente con CHIR 99021 3 µM y 100 ng / ml de Activina A durante las primeras 24 h, luego CHIR99021 0,3 µM y 100 ng / ml de Activina A al día siguiente y 100 ng / ml de Activina A durante el último día. Etapa 2 (2 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 suplementado con 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, Glucosa 10 mM, BSA al 0,5%, ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma) y FGF7 50 ng / ml (Peprotech). Etapa 3 (2 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 suplementado con 2,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, glucosa 10 mM, BSA al 2%, ácido ascórbico 0,25 mM, ITS-X 1: 200 (Thermo Fisher) , 50 ng / ml de FGF7, 1 µm de RA, 0,25 µM de Sant-1 (Sigma), 100 nM de LDN193189 (LDN; Stemgent) y 200 nM de TPB (EMD Millipore). Etapa 4 (3 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 complementado con 2,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, glucosa 10 mM, BSA al 2%, ácido ascórbico 0,25 mM, ITS-X 1: 200, 2 ng / ml de FGF7, ácido retinoico 0,1 µm, Sant-1 0,25 µM, LDN 200 nM y TPB 100 nM. 2% de BSA, 0,25 mM de ácido ascórbico, 1: 200 de ITS-X (Thermo Fisher), 50 ng / ml de FGF7, 1 µm de RA, 0,25 µM de Sant-1 (Sigma), 100 nM de LDN193189 (LDN; Stemgent) y 200 nM TPB (EMD Millipore). Etapa 4 (3 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 complementado con 2,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, glucosa 10 mM, BSA al 2%, ácido ascórbico 0,25 mM, ITS-X 1: 200, 2 ng / ml de FGF7, ácido retinoico 0,1 µm, Sant-1 0,25 µM, LDN 200 nM y TPB 100 nM. 2% de BSA, 0,25 mM de ácido ascórbico, 1: 200 de ITS-X (Thermo Fisher), 50 ng / ml de FGF7, 1 µm de RA, 0,25 µM de Sant-1 (Sigma), 100 nM de LDN193189 (LDN; Stemgent) y 200 nM TPB (EMD Millipore). Etapa 4 (3 días): las células se expusieron a medio MCDB 131 complementado con 2,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, glucosa 10 mM, BSA al 2%, ácido ascórbico 0,25 mM, ITS-X 1: 200, 2 ng / ml de FGF7, ácido retinoico 0,1 µm, Sant-1 0,25 µM, LDN 200 nM y TPB 100 nM.

Generación y expansión de PP-esferoides

Puede encontrar un protocolo paso a paso que describe el protocolo de cultivo de esferoides PP 3-D a largo plazo en Protocol Exchange ⁷⁷. Los progenitores pancreáticos generados a partir de hPSC (HuES4, H9, H1, SBAD3.1 y SBAD3.4) se disociaron en St4d8 del protocolo Ameri o St4d3 del protocolo Rezania usando TrypLE Express Enzyme (Thermo Fisher) para generar una suspensión de una sola célula y corrió a través de un filtro de células de 35 µm. Se tomó una muestra para acceder a la eficiencia de diferenciación por FACS. Las células se consideraron para la formación de esferoides de PP si al menos el 60% de las células eran PDX1 +. Antes de volver a sembrar en placa, las células se lavaron con medio de expansión (DMEM / F12 Glutamax, inhibidor de ROCK 10 µM Y-27632, 64 ng / ml de FGF2 y suplemento de B-27) y se resuspendieron en una mezcla de tres partes de GFR-Matrigel y una parte de medio de expansión. Las células se sembraron en placas a una densidad de 1000 células / µl de mezcla de Matrigel en placas de cultivo de células Nunc tratadas de cuatro pocillos (Thermo Fisher). La suspensión de células de Matrigel se dispensó lentamente en el centro de las placas precalentadas para formar una cúpula 3D, y se añadió medio después de la polimerización de Matrigel. El medio se cambió cada 3 días hasta el pasaje. La presencia del inhibidor de ROCK Y-27632, aunque estrictamente necesaria para el pase, no fue necesaria para todas las líneas celulares durante todo el tiempo de cultivo. Sin embargo, para mantener las condiciones lo más uniformes posible, optamos por mantener el inhibidor de ROCK Y-27632 en el medio de cultivo de forma predeterminada. Después de 10 días en cultivo, los PP-esferoides se disociaron con TrypLE o una solución de disociación que contenía tripsina al 0,25% (Thermo Fisher) y EDTA 5 mM (Thermo Fisher) en 1 x PBS, durante 5-8 min. Las células individuales se filtraron como se mencionó anteriormente, se cuantificaron con el NucleoCounter NC-200 y se volvieron a sembrar.

Cariograma de PP-esferoides

El cariograma se analizó en extensiones en metafase de H9 PP-esferoides en P5 (Organisation Genetische Diagnostik Institut für Klinische Genetik Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus TU Dresden). Además, se analizaron los esferoides de PP H9 en P12 en busca de variantes de número de copias mayores de 350.000 pb (Life & Brain GENOMICS, Bonn, Alemania), y no se informó ninguna aberración cromosómica mayor.

Generación y expansión de esferas fetales.

Después de la disección del páncreas fetal y la eliminación del mesénquima, la muestra se digirió con 250 U / ml de colagenasa tipo IV (Thermo Fisher) durante 10 a 20 min a 37 ° C, combinada con disociación mecánica cada 5 a 10 min mediante pipeteo, hasta que solo se formaron pequeños grumos quedaba de tejido. La enzima se inactivó con FBS y las células se lavaron en medio de expansión. De manera similar a la preparación de PP-esferoide, las células se suspendieron en una mezcla de tres partes de GFR-Matrigel en una parte de medio de expansión y se sembraron en placas de cultivo de células Nunc tratadas de cuatro pocillos. Después de 10 a 15 días, las esferas fetales se pasaron mediante un procedimiento idéntico, excepto una incubación con colagenasa tipo IV más corta (5 a 10 min).

Análisis inmunohistoquímico de PP-esferoides y esferas fetales

Los PP-esferoides y las esferas fetales (de HuES4, H9 y H1) se fijaron con PFA al 4% (Thermo Fisher) durante 20-30 min según el tamaño, se lavaron tres veces en 1 × PBS y se incubaron en una solución de sacarosa al 15% (Sigma ) hasta equilibrar (aproximadamente 1 h). A continuación, el tejido se incubó en gelatina durante 30 min a 40 ° C, seguido de incubación a 4 ° C durante 15 min. Después de solidificar, los bloques resultantes se congelaron en isopentano (Sigma) entre -60 y -70 ° C durante 1 min y se almacenaron inmediatamente a -80 ° C. Los PP-esferoides o esferas fetales se crioseccionaron en rodajas de 7 µm de grosor utilizando un criostato CM1950 (Leica) y se recogieron en portaobjetos Superfrost Plus Adhesion (Thermo Fisher). Los portaobjetos se rehidrataron en TBS-T, 1 × solución salina tamponada con tris (TBS) casera con Triton X-100 (Sigma) al 0,1%, durante 10 minutos y se permeabilizaron en una solución de Triton X-100 al 0,25% en 1 × TBS durante 10 minutos. min. A continuación, los portaobjetos se lavaron con TBS-T y se incubaron en CAS-Block (Thermo Fisher) durante 1 h. Se agregaron anticuerpos primarios a CAS-Block a la concentración recomendada y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Después de lavar a fondo los anticuerpos primarios con TBS-T, los anticuerpos secundarios (conjugados Alexa Fluor) y DAPI (Thermo Fisher) se diluyeron en CAS-Block y se aplicaron al portaobjetos durante 1 h. Los portaobjetos se lavaron de nuevo a fondo con TBS-T y se montaron con glicerol al 50% (Sigma) en 1 x PBS. Las fuentes y concentraciones de anticuerpos se indican en la tabla complementaria. Los anticuerpos secundarios (conjugados de Alexa Fluor) y DAPI (Thermo Fisher) se diluyeron en CAS-Block y se aplicaron al portaobjetos durante 1 h. Los portaobjetos se lavaron de nuevo a fondo con TBS-T y se montaron con glicerol al 50% (Sigma) en 1 x PBS. Las fuentes y concentraciones de anticuerpos se indican en la tabla complementaria. Los anticuerpos secundarios (conjugados de Alexa Fluor) y DAPI (Thermo Fisher) se diluyeron en CAS-Block y se aplicaron al portaobjetos durante 1 h. Los portaobjetos se lavaron de nuevo a fondo con TBS-T y se montaron con glicerol al 50% (Sigma) en 1 x PBS. Las fuentes y concentraciones de anticuerpos se indican en la tabla complementaria. 1 . Todas las imágenes se adquirieron utilizando el Zeiss LSM 780 con el software Zeiss Zen Black.

Análisis inmunohistoquímico del páncreas fetal.

Las muestras de páncreas fetal se fijaron con PFA al 4% durante 60 min, se lavaron tres veces en 1 × PBS y se incubaron en una solución de sacarosa al 15% durante la noche. El procedimiento restante fue idéntico al descrito para el análisis inmunohistoquímico de PP-esferoides y esferas fetales.

Inmunotinciones completas de PP-esferoides y esferas fetales

Los PP-esferoides (de HuES4, H9 y H1) y las esferas fetales se fijaron con PFA al 4% durante 20 a 30 min, según el tamaño, se lavaron tres veces en 1 × PBS y luego se deshidrataron gradualmente a metanol (Sigma), en el cual punto que podrían almacenarse a -20 ° C. Cuando fue aplicable, se realizó un paso de extinción incubando muestras con un 30% de metanol / DMSO / H ₂ O ₂mezclar (Sigma) en una proporción de 4/1/1 durante la noche en PBS. Después de esto, la muestra se rehidrató gradualmente a 1 x PBS y se incubó en bloque CAS durante la noche. Los anticuerpos primarios se agregaron a CAS-Block a la concentración recomendada y se incubaron de 24 a 48 ha 4 ° C. Después de lavar a fondo los anticuerpos primarios con 1 × PBS que contenía Triton X-100 (PBS-T) al 0,1%, los anticuerpos secundarios (conjugados de Alexa Fluor) y DAPI o DRAQ5 (Thermo Fisher) se diluyeron en CAS-Block y se incubaron con la muestra durante la noche. a 4 ° C. Las muestras se lavaron de nuevo a fondo con PBS-T y se montaron con glicerol al 60% en 1 x PBS. Las fuentes y concentraciones de anticuerpos se indican en la Tabla complementaria 1 . Todas las imágenes se tomaron utilizando el Zeiss LSM 780 con el software Zen Black o Leica TCS SP8 con el software LAS X.

Análisis de citometría de flujo de esferoides de PP

Las células disociadas (de HuES4, H9, H1 y SBAD3.4) se lavaron en 1 × PBS, se tiñeron con un tinte fantasma apropiado (TONBO biociencias) en BSA al 1% en PBS, se lavaron en 1 × PBS y luego se fijaron en 4%. PFA durante 20 min en hielo. Las células fijadas se lavaron en 1 x PBS y luego se permeabilizaron en PBS con suero de burro al 5% (Sigma) y Triton X-100 al 0,2% durante 30 min a 4ºC. Las células se incubaron con anticuerpos primarios en 1 x PBS con suero de burro al 5% y Triton X100 al 0,1% durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces en 1 x PBS y los anticuerpos no conjugados se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios (conjugados de Alexa Fluor) durante 45 min. Las fuentes y concentraciones de anticuerpos se indican en la Tabla complementaria 1.. Las células se analizaron utilizando un LSRFortessa o FACSAria III (BD Biosciences), y los datos se analizaron con el software FACSDiva (BD Biosciences), FlowJo (BD Biosciences) y FCS Express 6 (De Novo Software). Análisis de datos Representante y estrategia gating se ejemplifican en complementario Fig. 6 .

Transcripción inversa: análisis cuantitativo por PCR

Para la purificación del ARN, las células se lavaron dos veces con PBS 1x, se lisaron en tampón RLT (kit QIAGEN RNeasy Mini o Micro) que contenía 1% de β-mercaptoetanol (Sigma) y se almacenaron a -80 ° C hasta su procesamiento. El ARN total se aisló de PP-esferoides, esferas fetales o páncreas fetal utilizando el kit RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se digirió con DNasa I (QIAGEN) para eliminar el ADN genómico. La síntesis de ADNc de primera hebra se realizó con el sistema Superscript III (Thermo FIsher) usando cebadores aleatorios (Thermo Fisher) y se amplificó usando SYBR-Green (Thermo Fisher). Los cebadores de PCR se diseñaron utilizando Primer3Plus (Untergasser et al. 2012 ⁷⁸ ) y se validaron para una eficiencia que oscilaba entre el 95 y el 105%. Las secuencias de cebadores de los genes utilizados en qRT-PCR se enumeran en la Tabla complementaria 2. Para qPCR, se utilizó el sistema de PCR en tiempo real StepOnePLUS (Thermo Fisher) para placas de 96 pocillos o el instrumento LightCycler 480 II (Roche) para placas de 384 pocillos. Los valores de expresión para cada gen se normalizaron frente a ACTB y RPL7, utilizando los métodos delta CT o delta-delta CT.

Detección de EdU en PP-esferoides y esferas fetales

Los PP-esferoides (HUES4, SBAD3.4) y las esferas fetales se incubaron con 10 µM de EdU (kit Click-iT EdU; Thermo Fisher) en medio de expansión durante 4 ha 37 ° C. Luego, se prepararon PP-esferoides para citometría de flujo como se describió anteriormente, mientras que las esferas fetales se procesaron para inmunotinción de montaje completo. La permeabilización, el bloqueo y la reacción Click-iT para la detección de EdU se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Análisis de datos Representante y gating estrategia para la citometría de flujo se ejemplifica en complementario Fig. 6 .

Diferenciación endocrina y exocrina en PP-esferoides

Después de 10 días de cultivo, se cambió el medio de expansión para inducir la diferenciación endocrina o exocrina.

Diferenciación Endocrine (basado en Etapas 5 y 6 de la Rezania et al. ¹⁶ de protocolo)

Etapa 5 (3 días): PP-esferoides (de HuES4, H9, H1 y SBAD3.4) se expusieron a medio MCDB 131 suplementado con 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, 20 mM de glucosa, 2% de BSA, 1: 200 ITS-X, sulfato de zinc 10 µM (Sigma), ácido retinoico 0,05 µm, Sant-1 0,25 µM, LDN 100 nM, inhibidor II de ALK5 10 µM (Enzo), T3 1 µM (Sigma) y 10 µg / ml de heparina (Sigma). El medio se cambió a diario. Etapa 6 (7-14 días): PP-esferoides se expusieron a medio MCDB 131 suplementado con 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 1 × Glutamax, 20 mM de glucosa, 2% de BSA, 1: 200 ITS-X, 10 µM de sulfato de zinc , LDN 100 nM, inhibidor II de ALK5 10 µM, T3 1 µM, heparina 10 µg / ml y GSiXX 100 nM (EMD Millipore). El medio se cambió a diario.

Diferenciación exocrina (basada en ⁵² )

Quince días de tratamiento: PP-esferoides (H9) se expusieron a medio DMEM / F12 GlutaMAX suplementado con 15 ng / ml de FGF7, nicotinamida 10 mM (Sigma), 100 ng / ml de Exendina4 (análogo de GLP1, Sigma), B27 y suplementos de N2 (Thermo Fisher).

Configuración de cribado, cuantificación y validación de ATP

Los PP-esferoides (HUES4) en el paso 3 se disociaron como se describió anteriormente. Se utilizó un robot de manipulación de líquidos Bravo (Agilent) para depositar 8 µl de suspensión celular en todos los pocillos menos 3 de un OptiPlate de 96 pocillos (PerkinElmer). Se añadió una mezcla de GFR-Matrigel sin células a los últimos tres pocillos, para que sirviera como control negativo. Durante las primeras 48 h, los PP-esferoides se cultivaron normalmente en un medio de expansión. Después de 48 h se retiró el medio de expansión, los pocillos se lavaron con 1 × PBS dos veces y se agregaron diferentes medios por triplicado, incluidas 26 condiciones y 3 controles (detalles en la Tabla complementaria 3). El medio se cambió de nuevo los días 5 y 8. Después de un total de 10 días en cultivo, se realizó el ensayo de luciferasa Cell Titer-Glo (Promega) según las instrucciones del fabricante, y se midió la luminosidad en el omega LUMIstar (BMG Labtech). Los experimentos de validación se realizaron en placas Nunc de 4 pocillos con las líneas celulares HUES4 y SBAD3.4, con la misma línea de tiempo utilizada en el experimento de detección original, excepto para Infigratinib, que solo se agregó del día 9 al 10. Las células se recogieron en los días 5 y 10 de cultivo para la cuantificación de EdU. La validación en esferas fetales se realizó en portaobjetos µ de 8 pocillos (Ibidi).

Secuenciación y análisis de ARN unicelular

La generación de perfiles transcriptómicos unicelulares de PP-esferoides (HUES4, H1 y SBAD3.4), cultivos de células 2D (HUES4), esferas fetales y páncreas fetal se realizó utilizando el protocolo MARS-seq como se describe ²⁵ . Las células individuales se clasificaron utilizando BD FACSAria III (BD Biosciences) o Sony SH800 (Sony). La preparación satisfactoria de la biblioteca se confirmó utilizando el dispositivo Fragment Analyzer (Agilent) con el kit DNA HS (Agilent). Las bibliotecas se secuenciaron usando Illumina Next-seq 500. Los archivos fastq R1 y R2 se generaron usando bcl2fastq v2.19.1, y la información de pozos y agrupaciones de la secuencia se extrajo en un archivo fastq único usando umis v1.0.3. Luego, las lecturas se filtraron en función de los códigos de barras agrupados con 1 desajuste permitido. Los poly-Ts al final de las secuencias se recortaron usando cutadapt v1.18⁷⁹ . Las lecturas se asignaron al genoma humano (GRCh38 junto con ERCC92) usando hisat2 v2.1.0⁸⁰ , archivos bam generados, ordenados e indexados con samtools v1.7⁸¹ , lecturas contadas con featureCounts (subread v1.5.3)⁸² usando Ensembl versión 93, y los umis usan umi_tools v1.0.0⁸³ . Se usó SCATER v1.12.2⁸⁴ para excluir células de baja calidad basándose en tres covariables de QC (profundidad de recuento, genes por célula y fracción de genes mitocondriales). Con este método se obtuvo un promedio de 2500 lecturas por célula y 1500 genes por célula. Las células se asignaron a la fase G1, G2 / M o S utilizando la función de ciclón de Scran v1.12.1⁴⁷ . Se realizó un análisis computacional adicional utilizando Seurat 3.0.3⁸⁵ . Los 2000 genes de las principales variables se calcularon utilizando el método de transformación de estabilización de la varianza, y la integración de datos se realizó utilizando conjuntos de anclajes calculados previamente para eliminar los efectos de secuenciación por lotes. Después de ejecutar PCA en los datos integrados escalados,se ejecutó lareducción dimensional^{86 de} aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP)para visualizar las células. Los grupos de células con patrones de expresión similares se determinaron mediante el uso de las funciones FindNeighbors () y FindClusters () en Seurat 3.0.3 (consulte los scripts depositados en github para obtener parámetros específicos). La función FindAllMarkers () en Seurat 3.0.3 se utilizó para obtener listas de genes expresados diferencialmente en poblaciones definidas en todo el conjunto de datos. Las visualizaciones se generaron utilizando Seurat 3.0.3 y ggplot2⁸⁷.

Comparación de datos de secuenciación de ARN unicelular fetal humano con datos de secuenciación de ARN unicelular embrionario de ratón

Los datos de scRNAseq embrionario de ratón del páncreas en la etapa E12.5 (E12.5 SW) se obtuvieron de ³² ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM3140915). Se procesaron los datos del ratón y se asignó la identidad del clúster con Seurat v3.1.4. Para comparar datos fetales humanos con datos de ratones, se asignaron genes humanos con ortólogos de ratón descargados de Ensembl BioMart. Para encontrar ortólogos coincidentes, los genes de ratón tenían que coincidir con los criterios de «confianza en ortología de ratón = 1 (alta)» y «tipo de homología de ratón = ortholog_one2one». A todos los pares de genes humano-ratón se les asignó un nuevo identificador genético único. Luego, se utilizaron nuevos identificadores únicos para reemplazar los identificadores de genes específicos de la especie en los objetos Seurat de ratón y humanos (datos fetales). Los objetos Seurat humanos y de ratón se integraron luego con las funciones FindIntegrationAnchors e IntegrateData en Seurat, seguidas de escalado y agrupamiento de datos.

Para comparar la expresión génica entre grupos de humanos y ratones, la expresión de los 50 marcadores de grupos principales de grupos humanos (punta, tronco, endocrino) se comparó con las expresiones en los grupos de ratones correspondientes y se visualizó en un diagrama de puntos. Si no se indica lo contrario, todos los pasos se realizaron con la versión 3.6.3 de R.

Análisis de la comunicación célula-célula

Para permitir el análisis sistemático de la comunicación célula-célula, desarrollamos InterCom, un paquete R para inferir interacciones célula-célula mediadas por receptor-ligando funcional mediante la integración de eventos de unión extracelular con cascadas de señalización intracelular y regulación transcripcional.

InterCom se basa en un compendio de interacciones ligando-receptor validadas experimentalmente, redes de señalización intracelular e interacciones reguladoras de genes. Las interacciones ligando-receptor validadas experimentalmente se han recopilado de un conjunto de datos previamente publicado ⁸⁸ . Las interacciones se curaron aún más seleccionando solo ligandos anotados como «Secretados» en Uniprot ⁸⁹ . Además, se utilizó un andamio de red de señalización intracelular a partir de interacciones de vías incluidas en Omnipath ⁹⁰ , Reactome ⁹¹y MetaCore de Thomson Reuters. En particular, de estas bases de datos se han recopilado únicamente las interacciones relacionadas con la transmisión de señales, como los eventos de fosforilación y ubiquitinación. Finalmente, las interacciones reguladoras de la transcripción se obtuvieron de MetaCore de Thomson Reuters para genes humanos. Sólo se seleccionaron las interacciones reguladoras de la transcripción con efectos conocidos, es decir, activación o inhibición, filtrando las interacciones directas, siendo el efecto informado la activación o la inhibición.

El flujo de trabajo principal de InterCom consta de los siguientes pasos. Primero, para cada tipo de célula, identificamos factores de transcripción cuya expresión se conserva en un subconjunto de células. En particular, transformamos los datos de expresión en un formato binario, en el que los TF con al menos un recuento se convierten en 1, mientras que los TF no expresados se convierten en -1, y los TF seleccionados se expresan en el percentil cinco superior de las células.

En segundo lugar, InterCom detecta receptores funcionales que inducen estos TF conservados. empleamos un modelo de cadena de Markov de señalización intracelular, llamado SigHotSpotter, para identificar la molécula intermedia de alta probabilidad ⁹². En resumen, SigHotSpotter utiliza datos de secuencia de ARN de una sola célula de un tipo de célula y la red de señalización intracelular inicialmente ensamblada para crear una matriz de transición de estado que representa el recorrido de una señal a través de la red. La matriz de transición de estado representa una cadena de Markov discreta finita y posteriormente evoluciona para crear la distribución estacionaria. La distribución estacionaria muestra las moléculas intermedias que exhiben las mayores probabilidades de estado estable. Estas moléculas intermedias luego se conectan a los primeros factores de transcripción en la cadena de transducción de señales y se evalúa su compatibilidad transcripcional. Las moléculas intermedias se consideran compatibles,p <0,05). De manera similar, los receptores están conectados a moléculas intermedias, si existe una ruta que sea compatible. Con el tiempo, solo se retienen los receptores que se coexpresan con sus TF de interfaz y dianas aguas abajo en al menos el 5% de las células.

Finalmente, las interacciones ligando-receptor se establecen entre dos tipos de células, si el receptor tiene un efecto aguas abajo, el ligando se expresa en más del 5% de las células y la interacción está presente en el andamio de interacción. Una puntuación de interacción se define como el producto de la expresión media del receptor y la expresión media del ligando en todas las células de una población que expresan el receptor o ligando, respectivamente. La importancia se evalúa comparando las puntuaciones de todas las posibles interacciones célula-célula contenidas en el andamio entre los dos tipos de células que interactúan. Las puntuaciones en el decil superior se consideran significativas.

Análisis de imagen

Se analizaron imágenes de montaje completo de esferas fetales y se obtuvo la cuantificación de EdU mediante segmentación semimanual utilizando la herramienta de detección de superficies del software IMARIS v9.0.2 (Bitplane). La cuantificación de MKI67 a partir de muestras histológicas de páncreas fetal humano, esferas fetales y PP-esferoides se realizó utilizando la distribución ImageJ Fiji ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/ Fiji). Se utilizó un script automatizado para realizar los siguientes pasos: desenfoque gaussiano (sigma = 3); establecer umbral (oscuridad predeterminada); convertir en máscara; cuenca; analizar partículas (tamaño = 6, mostrar contornos); medir la intensidad en cada región de interés (ROI). El umbral de intensidad de la señal se determinó manualmente para cada muestra.

Cuantificación y análisis estadístico

Las pruebas estadísticas se realizaron con GraphPad Prism (6–8). La significancia se definió como * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001. Los valores de p se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney bilateral, a menos que se indique lo contrario. El número de réplicas se indica en las leyendas de las figuras, donde N indica el número de experimentos independientes y n indica el número total de mediciones. A menos que se indique lo contrario, los datos se representan como la media ± error estándar de la media (SEM).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos de secuenciación de una sola célula sin procesar se han depositado en el archivo europeo de genomas y fenomas EGA ( https://ega-archive.org/ ) con el número de identificación EGAD00001007506 y los datos procesados se pueden consultar en el navegador de células UCSC ( https: // páncreas humanodev.cells.ucsc.edu ). Las cifras que tienen datos brutos asociados son las Figs. 1 , 3 , 7 y las Figs. Suplementarias. 1, 3, 7. Usamos Ensembl ⁹³ para la anotación de genes y las identificaciones de genes homólogos. Para los análisis de InterCom, se utilizaron varias bases de datos de secuencias de proteínas, incluidas Uniprot ⁸⁹ , Omnipath ⁹⁰ , Reactome ⁹¹y MetaCore de Thomson Reuters. Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria, y que todos los datos relevantes están disponibles a través de los autores.

Disponibilidad de código

El código fuente de InterCom está disponible en https://github.com/saschajung/InterCom . Otros códigos están disponibles en https://dx.doi.org/21.11101/0000-0007-E7E3-4 .

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Agradecimientos

Agradecemos a Henrik Semb por la línea celular HuES4 PDX1-eGFP. Agradecemos a DanStem Genomics Platform, en particular a Magali Michaut y Helen McNeil, así como a Michaela Rothova por configurar MARS-Seq. También estamos agradecidos a las instalaciones de cultivo de células madre, citometría de flujo e imágenes y al personal de DanStem y MPI-CBG por la capacitación, la experiencia técnica, el apoyo y el uso de instrumentos. El procesamiento y análisis de datos de la Plataforma Genómica se realizó utilizando la Supercomputadora Nacional de Ciencias de la Vida DeiC en DTU ( www.computerome.dk). Agradecemos a Josh Brickman por sus comentarios sobre el manuscrito. El Centro de Biología de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo de una subvención de la Fundación Novo Nordisk número NNF17CC0027852. El proyecto fue apoyado por subvenciones 7016-00045B de Det Frie Forskningsråd y DNRF 116 de la Danish National Research Foundation a AGB

Fondos

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Información del autor

Afiliaciones

Centro de Biología de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca

Carla A. Gonçalves, Michael Larsen, Akiko Nakamura y Anne Grapin-Botton
CIC bioGUNE-BRTA (Alianza Vasca de Investigación y Tecnología), Derio, España

Sascha Jung y Antonio del Sol
Instituto Max Planck de Biología Celular Molecular y Genética, Dresde, Alemania

Johannes Stratmann, Marit Leuschner, Lena Hersemann, Rashmiparvathi Keshara, Yung Hae Kim y Anne Grapin-Botton
Departamento de Ginecología, Hospital Universitario de Copenhague (Rigshospitalet), Copenhague, Dinamarca

Signe Perlman y Lene Lundvall
Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Universitario de Hvidovre, Hvidovre, Dinamarca

Lea Langhoff Thuesen y Kristine Juul Hare
El instituto Weizmann, Rehovot, Israel

Ido Amit
Departamento de Crecimiento y Reproducción, Hospital Universitario de Copenhague (Righshospitalet), Copenhague, Dinamarca

Anne Jørgensen
Centro de Biomedicina de Sistemas de Luxemburgo (LCSB), Universidad de Luxemburgo, Belvaux, Luxemburgo

Antonio del Sol
IKERBASQUE, Fundación Vasca para la Ciencia, Bilbao, España

Antonio del Sol

Contribuciones

AGB y CAG conceptualizaron la idea del proyecto. AN realizó experimentos piloto y contribuyó a experimentos que implican la diferenciación de hESC a progenitores pancreáticos. CAG optimizó y caracterizó el sistema de cultivo, diseñó y realizó todos los demás experimentos, analizó los datos y redactó el manuscrito. M. Larsen realizó disecciones de páncreas fetal y optimización de métodos de cultivo primario. M. Leuschner, RK y YHK contribuyeron a los experimentos de diferenciación endocrina. JS realizó las comparaciones de datos de humanos y ratones. LH escribió y proporcionó plantillas de guiones y asesoró sobre bioinformática. SJ llevó a cabo la implementación del modelo de red de comunicación celda-celda (InterCom) y su análisis. AdS supervisó la implementación del modelo de red de comunicación celular (InterCom) y su análisis. CAG, JS, S. J, AdS y AGB contribuyeron a la redacción del manuscrito. M. Leuschner, AJ, SP, LL, LLT y KJH aislaron muestras de páncreas fetal humano. IA brindó apoyo para la implementación de la tecnología MARS-seq. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición del manuscrito.

Autor correspondiente

Correspondencia a Anne Grapin-Botton

FUENTE: www.nature.com

Etiquetas: 3D páncreas transcriptoma unicelular