La edición del genoma basada en Retron ha estado invitando a comparaciones con la edición del genoma basada en CRISPR, especialmente desde que los investigadores han aprendido que los retrones, como los sistemas CRISPR, funcionan como una especie de sistema inmunológico en bacterias. Sin embargo, las comparaciones pueden ser un poco prematuras. La edición del genoma basada en Retron aún no ha funcionado en células de mamíferos. No obstante, ya se ha demostrado que las retronas ofrecen ventajas únicas en las aplicaciones de edición del genoma.
El último avance en la edición del genoma basada en retron proviene de investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard y la Escuela de Medicina de Harvard (HMS). Informan que han creado una nueva herramienta para la edición del genoma basada en retron. La herramienta, que se llama Retron Library Recombineering (RLR), se puede utilizar para realizar pantallas funcionales de alto rendimiento que superan la escala y la especificidad de las pantallas habilitadas por la tecnología CRISPR-Cas.
RLR genera hasta millones de mutaciones simultáneamente e inserta «códigos de barras» en las células mutantes para que todo el conjunto se pueda analizar a la vez, lo que permite generar y analizar fácilmente cantidades masivas de datos. Una descripción del rendimiento de RLR en células bacterianas apareció el 29 de abril en las Actas de la Academia Nacional de Ciencias (PNAS) , en un artículo titulado » Detecciones de variantes funcionales de alto rendimiento mediante la producción in vivo de ADN monocatenario «.
«Utilizamos la actividad de transcripción inversa dirigida de retrones para producir ADN de cadena sencilla (ssDNA) in vivo, incorporando ediciones con una eficiencia> 90% y permitiendo aplicaciones multiplexadas», escribieron los autores del artículo. “RLR introduce simultáneamente muchas variantes genómicas, produciendo bibliotecas de variantes agrupadas y con códigos de barras direccionables mediante secuenciación profunda dirigida.
“Usamos RLR para el fenotipado combinado de alelos de resistencia a antibióticos sintetizados, lo que demuestra la medición cuantitativa de las tasas de crecimiento relativas. También realizamos RLR utilizando el ADN genómico cortado de una bacteria evolucionada, interrogando experimentalmente millones de secuencias en busca de variantes causales, lo que demuestra que RLR es especialmente adecuado para utilizar grandes grupos de variación natural «.
Las retronas (complejos de ADN, ARN y proteínas) son retroelementos bacterianos poco comprendidos que se someten a una transcripción inversa dirigida, que producen ADN satélite multicopia monocatenario (msDNA). Varios equipos de investigación han demostrado que msDNA puede funcionar como un donante recombinante, creando ediciones específicas en el genoma. Esta capacidad sugiere que las retronas podrían funcionar como parte de un método de edición del genoma de «solo donante», a diferencia de CRISPR, que suele ser un método de «donante + guía».
Otro atractivo de los retrones es que sus propias secuencias pueden servir como «códigos de barras» que identifican qué individuos dentro de un grupo de bacterias han recibido cada secuencia de retrones, lo que permite pantallas agrupadas dramáticamente más rápidas de cepas mutantes creadas con precisión.
La recombinación de Retron se ha utilizado en varios estudios, incluidos los de biología sintética, pero las tasas de edición fueron bajas, demasiado bajas para que la edición del genoma basada en retrones sea práctica para estudiar mutantes de interés fisiológico.
Para ver si la recombinación de retron podría ser más eficiente, los científicos de Wyss primero crearon plásmidos circulares de ADN bacteriano que contenían genes de resistencia a antibióticos colocados dentro de secuencias de retron, así como un gen de proteína de hibridación de cadena sencilla (SSAP) para permitir la integración de la secuencia de retron en el genoma bacteriano. Insertaron estos plásmidos retron en la bacteria Escherichia coli para ver si los genes se integraron con éxito en sus genomas después de 20 generaciones de replicación celular. Inicialmente, menos del 0,1% de E. coli que lleva el sistema de recombinación retron incorporó la mutación deseada.
Para mejorar este decepcionante rendimiento inicial, el equipo hizo varios ajustes genéticos a la bacteria. En primer lugar, inactivaron la maquinaria de reparación de errores de apareamiento natural de las células, que corrige los errores de replicación del ADN y, por lo tanto, podría estar «arreglando» las mutaciones deseadas antes de que pudieran pasar a la siguiente generación. También inactivaron dos genes bacterianos que codifican exonucleasas, enzimas que destruyen el ADNss flotante. Estos cambios aumentaron drásticamente la proporción de bacterias que incorporaron la secuencia de retroceso, a más del 90% de la población.
Ahora que estaban seguros de que su ssDNA de retron se había incorporado a los genomas de sus bacterias, el equipo probó si podían utilizar los retron como un «atajo» de secuenciación genética, lo que permitió realizar muchos experimentos en una mezcla. Debido a que cada plásmido tenía su propia secuencia de retron única que puede funcionar como una «etiqueta de nombre», razonaron que deberían poder secuenciar el retron mucho más corto en lugar de todo el genoma bacteriano para determinar qué mutación habían recibido las células.
Primero, el equipo probó si RLR podía detectar mutaciones conocidas de resistencia a antibióticos en E. coli . Descubrieron que sí: las secuencias de retroceso que contenían estas mutaciones estaban presentes en proporciones mucho mayores en sus datos de secuenciación en comparación con otras mutaciones. El equipo también determinó que RLR era lo suficientemente sensible y preciso como para medir pequeñas diferencias en la resistencia que resultan de mutaciones muy similares. Fundamentalmente, la recopilación de estos datos mediante la secuenciación de códigos de barras de todo el conjunto de bacterias en lugar de aislar y secuenciar mutantes individuales, acelera drásticamente el proceso.
Luego, los investigadores llevaron el RLR un paso más allá para ver si podía usarse en ADN fragmentado aleatoriamente y descubrir cuántos retrones podían usar a la vez. Cortaron el genoma de una cepa de E. coli altamente resistente a otro antibiótico y usaron esos fragmentos para construir una biblioteca de decenas de millones de secuencias genéticas contenidas dentro de secuencias de retrones en plásmidos.
«La simplicidad de RLR realmente brilló en este experimento, porque nos permitió construir una biblioteca mucho más grande que la que podemos usar actualmente con CRISPR, en la que tenemos que sintetizar tanto una guía como una secuencia de ADN del donante para inducir cada mutación». dijo Max Schubert, PhD, co-primer autor del artículo de PNAS y postdoctorado en el laboratorio del miembro principal de la facultad de Wyss, George Church, PhD, autor principal del artículo y dirige el área de enfoque de biología sintética del Instituto Wyss y también es profesor de genética en HMS.
Esta biblioteca se introdujo luego en la cepa de E. coli optimizada para RLR para su análisis. Una vez más, los investigadores encontraron que los retrones que confieren resistencia a los antibióticos podían identificarse fácilmente por el hecho de que se enriquecían con respecto a otros cuando se secuenciaba el grupo de bacterias.
“Ser capaz de analizar bibliotecas de mutantes con códigos de barras agrupadas con RLR permite realizar millones de experimentos simultáneamente, lo que nos permite observar los efectos de las mutaciones en todo el genoma, así como cómo esas mutaciones podrían interactuar entre sí”, dijo Church. «Este trabajo ayuda a establecer una hoja de ruta hacia el uso de RLR en otros sistemas genéticos, lo que abre muchas posibilidades interesantes para la investigación genética futura».
FUENTE: www.genengnews.com
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